Doping je kljub razvoju številnih analitskih metod še vedno težaven z vidika detekcije. Čeprav imamo danes na voljo visoko specifične in občutljive metode z nizko mejo detekcije, se moramo zavedati omejitev, ki nam onemogočajo zaznavanje številnih novih prepovedanih substanc in njihovih metabolitov. Odkrivanje dopinga v bioloških vzorcih včasih otežujejo že same lastnosti snovi (npr. kratka razpolovna doba, cirkadialni ritem hormonov). Poleg tega je potrebno upoštevati, da so nekatere prepovedane snovi v določenem intervalu tudi sicer normalno endogeno prisotne v organizmu (hormoni).
VRSTE DOPINGA
Izraz doping se nanaša na uporabo prepovedanih substanc, zdravil, drog in oblik zdravljenja s strani športnikov, tako profesionalnih kot amaterskih, z namenom izboljšanja zmogljivosti in atletske uspešnosti v športu.
Genski doping
Nekateri izjemni rezultati genetske manipulacije laboratorijskih glodalcev in napredki v genski terapiji pri ljudeh so privedli do celega spektra genskega dopinga v športu.
Kandidatne tarče vključujejo:
- indukcijo mišične hipertrofije s prekomernim izražanjem specifičnih različic inzulinu podobnega rastnega faktorja 1 (IGF-1) ali z blokado delovanja miostatina
- povečanje dostave kisika z višanjem hematokrita preko uporabe eritropoetina
- indukcijo angiogeneze z vaskularnimi endotelnimi rastnimi faktorji ali sorodnimi molekulami
- spremembe mišičnega fenotipa preko izražanja jedrnega receptorja PPAR-δ in podobnih molekul
Nekaj takšnih genetskih izboljšav, še posebej teh, pri katerih sta genetska modifikacija in učinek omejena na mišice, ne moremo detektirati s trenutnimi testi. To je vodilo v pretirane napovedi, da bo genski doping v atletiki zelo razširjen v naslednjih nekaj letih. Vendar lahko s pregledom metod genskega prenosa in genske terapije človeških bolezni vidimo, da je genski doping trenutno mogoč le v teoriji. Kljub temu pa je potrebno spremljati napredke v tehnologiji in razviti detekcijske metode, še posebej takšne, ki bodo lahko identificirale vzorce sprememb v odzivu na doping in ne le takšnih, ki bodo zaznale specifične prepovedane snovi v vzorcu.
Doping krvi
Masa hemoglobina je ključni faktor maksimalne zmogljivosti v športu. Nekateri športniki uporabljajo prepovedane tehnike in substance, da bi si maso hemoglobina povečali in s tem izboljšali fizično zmogljivost, kar pogosto težko dokažemo. Avtologne transfuzije eritrocitov po reinfuziji ne moremo zaznati in tudi rekombinantni eritropoetin se v krvi nahaja le določen čas. Novejše eritropoetske snovi, kot so mimiki eritropoetina in aktivatorji gena za eritropoetin, bi lahko kmalu prišle na dopinško sceno, kot tudi vnos samega gena za eritropoetin. Zaradi tega je WADA (World Anti-Doping Agency) postavila smernice, ki temeljijo na spremljanju različnih parametrov zrelih eritrocitov in retikulocitov. Ob nefizioloških spremembah teh parametrov lahko posumimo na doping krvi. Hematologi bi zato morali biti seznanjeni s krvnim dopingom in z ocenjevanjem krvnih profilov atletov pripomogli k njegovemu odkrivanju.
WADA definira doping krvi kot zlorabo nekaterih tehnik in/ali snovi za povečanje mase eritrocitov, kar v telesu poveča transport kisika do mišic in zato izboljša vzdržljivost in zmogljivost te osebe. Prepovedani postopki vključujejo uporabo umetnih prenašalcev kisika, transfuzijo eritrocitov, infuzijo hemoglobina in umetno stimulacijo eritropoeze. Pod prepovedane snovi WADA navaja eritropoetin, darbepoetin-α, HIF stabilizatorje, metoksi polietilen glikol-epoetin β (CERA) in peginesatid. Pod prepovedane metode pa izboljšanje prenosa kisika, intravenske infuzije polne krvi in genski doping – prenos nukleinskih kislin in nukleinskih sekvenc, uporabo normalnih ali gensko spremenjenih celic in uporabo snovi, ki neposredno ali posredno vplivajo na izražanje genov, ki prispevajo k zmogljivosti.
Doping s hormoni
Hormoni z anabolnimi učinki kot so rastni hormon, testosteron, inzulinu podobni rastni dejavnik 1 (IGF-1) in inzulin so pogosto zlorabljani s strani tako profesionalnih kot rekreativnih športnikov z namenom povečanja fizične zmogljivosti ali izboljšanja izgleda telesa. Ti hormoni v skeletnih mišicah namreč preko vezave na njihove receptorje spodbudijo sintezo oz. zavrejo razgradnjo proteinov. Ker je takšna vrsta dopinga še vedno razširjena, je izobraževanje o tveganjih uporabe teh substanc tako splošne javnosti kot zdravnikov zelo pomembno. Eno takšnih tveganj je razvoj odvisnosti do uporabljene snovi, pogosto pa se športniki odločijo za zlorabo več substanc hkrati, kar še povečuje tveganje za resne zdravstvene zaplete.
METODE DOLOČANJA DOPINGA V BIOLOŠKIH VZORCIH
Glede na kemijske značilnosti uporabljenih prepovedanih substanc v športu, uporabljamo različne metode določanja. Zelo pogosto so v uporabi imunokemijske tehnike, plinska oziroma tekočinska kromatografija z masno detekcijo in izoelektrično fokusiranje.
- Imunokemijske tehnike pogosto uporabljamo za merjenje hormonov v serumu. Svetovna protidopinška organizacija jih priporoča predvsem pri določanju uporabe rekombinantnega rastnega hormona in testosterona pri športnikih. Osnova imunokemijskih metod je detekcija vezave antigen- specifično protitelo. Poznamo številne imunokemijske metode, ki nam omogočajo detekcijo hormonov. Za detekcijo rastnega hormona in testosterona se v praksi uporablja tako imenovana kemiluminiscentna metoda. Pri tej metodi so na mikrotitersko ploščico vezana protitelesa. V reakcijski zmesi je z encimom označen antigen, ki je analog hormona. Označeni antigen iz reagenta tekmuje z neoznačenim antigenom iz vzorca za vezavo na protitelo. Dodamo luminiscenten substrat in izmerimo luminiscenco. V primeru, da je v vzorcu prisoten iskan antigen, se bo ta vezal na protitelesa, z encimom označen antigen bomo odstranili v koraku spiranja. Po dodatku substrata ne bo prišlo pojava luminiscence (ni encima), zato bomo zaznali nižji signal.
- GC/MS je plinska kromatografija z masno detekcijo. Metoda je široko uporabna, saj je specifična in občutljiva, poleg tega pa omogoča relativno hitro prilagoditev ob pojavu novih substanc na tržišču. Pri plinski kormatografiji vzorec potuje skozi stekleno kolono skupaj z mobilno fazo. Mobilna faza pri plinski kromatografiji je inerten plin (vodik, helij). V koloni vzorec interagira s stacionarno fazo, ki je nanešena na kolono. Pogosto so za stacionarno fazo uporabljeni voski ali silika delci. Delci v vzorcu se v koloni ločijo na podlagi hitrosti izhlapevanja. Bolj hlapljive snovi, pripotujejo na konec kolone hitreje kot slabše hlapljive snovi. Te se v koloni zadržijo dlje časa. Izmerimo retencijski čas spojine in z detektorjem identificiramo in kvantificiramo iskano snov.
- Izoelektrično fokusiraje je priporočena metoda za določanje rekombinantnega človeškega eritropoetina v urinu. Izoelektrična točka (pI) je točka, pri kateri je neto naboj proteina 0. Izoelektrično fokusiranje je metoda, pri kateri proteini potujejo v električnem polju. Med elektrodama ustvarimo pH gradient, proteini potujejo med elektrodama in se ustavijo pri tistem pH, ki ustreza vrednosti njihove izoelektrične točke (torej kjer je njihov neto naboj enak 0). Na ta način v zmesi ločimo proteine in jih identificiramo glede na njihovo izoelektrično točko.
TEŽAVE PRI DETEKCIJI NEKATERIH SNOVI V DOPINGU
Kljub razvoju številnih novih metod za detekcijo substanc v dopingu, je boj proti dopingu še vedo zelo zahteven. Določanje v bioloških vzorcih otežujejo vedno novi načini prikrivanja uživanja tovrstnih substanc. Pri določenih snoveh (predvsem hormonih) je pri interpretaciji potrebno upoštevati tudi cirkadialne ritme in velike interindividualne razlike med posamezniki.
V nadaljevanju so opisani primeri substanc, ki so z vidika detekcije pogosto težavne.
- ERITROPOETIN: Eden izmed načinov povečanja prekrvavitve tkiv pri športnikih je strategija spravljanja telesa v stanje hipoksije (stanje znižane koncentracije kisika v tkivih). Posledično pride do fiziološko povečane produkcije hormona eritropoetina. Odkrili so, da dodatki elementa kobalta, ki je tudi sicer naravno prisoten v organizmu, stabilizira aktivatorje transkripcije eritropoetina pri hipoksiji in na ta način pospeši sintezo eritropoetina. Kobalt je lahko dostopen, poceni in ima kratko razpolovno dobo. Poleg tega ga WADA še ni umestila na seznam prepovedanih snovi.
Med športniki je razširjeno tudi apliciranje rekombinantnega eritropoetina. Z dodatkom proteaz, ki razgradijo rekombinantni eritropoetin, je v urinu otežena detekcija eksogenega eritropoetina.
- AVTOLOGNE TRANSFUZIJE KRVI: apliciranje lastne krvi predhodnem odvzemu, je eden izmed najstarejših načinov dopinga v športu in se še vedno uporablja. S transfuzijo povečamo število eritrocitov v krvi in posledično izboljšamo prekrvavljenost tkiv v telesu. Uporabo avtologne transfuzije je mogoče prikriti z uporabo dezmopresina in raztopin soli, ki povečajo volumen plazme in na ta način normalizirajo koncentracijo hematokrita v krvi, še preden športnik pride na odvzem krvi.
- RASTNI HORMON: v dopingu se je uporaba rastnega hormona močno razširila, saj ta spodbuja razgradnjo maščob (lipolizo), poveča mišično maso in moč, ter pospešuje regeneracijo tkiv. Določanje rastnega hormona je zelo težavno, saj je njegova serumska koncentracija podvržena cirkadialnemu ritmu in se ne sprošča kontinuirano, pač pa pulzirajoče. Rastni hormon ima ozko detekcijsko okno, zato ga športniki uporabljajo predvsem v času priprav na tekmovanje, na samem tekmovanju pa ne, in ga protidopinška kontrola na tekmovanju ne zazna več. Ker je rastni hormon endogena substanca, uporaba izjemno podobnega eksogenega hormona onemogoča razlikovanje med endogenim in rekombinantnim rastnim hormonom.
- TESTOSTERON: testosteron je še eden od hormonov, ki se zlorablja za namen dopinga. Testosteron poveča mišično moč in maso, ter zmanjšuje nastajanje maščobnega tkiva. V enem od korakov presnove testosterona poteče glukuronidacija testosterona in nastanek testosteron glukuronida. Le testosteron z vezano glukuronsko kislino je topen in se lahko izloča z urinom, kjer ga lahko zaznamo z izbrano metodo. Obstajajo različni načini za prikrivanje uporabe testosterona v športu. Pogosto je uživanje inhibitorjev encimov, ki katalizirajo reakcijo glukuronidacije (encim UGT2B17). Tudi uživanje določene hrane in pijače (zeleni čaj, rdeče vino) zavira reakcijo glukuronidacije testosterona. Povišane koncentracije testosterona pri dopinških kontrolah tako ne moremo zaznati v urinu, saj testosteron brez vezane glukuronske kisline ni topen in se z urinom ne izloča.
DOLOČANJE NOVIH SUBSTANC NA TRGU
Razvoj novih dopinških snovi, ki (še) niso na Listi prepovedanih snovi in postopkov, je hiter. Pogosto se razvijejo iz znanih snovi, ki jim le nekoliko spremenjeno strukturo, medtem ko ohranijo podobne biološke učinke. Zato protidopinški organi ves čas sledijo pojavljanju novih dopinških snovi. Sodelujejo s farmacevtsko industrijo glede pojavljanja farmacevtskih substanc, ki bi bile lahko uporabljene za namene dopinga in z istim namenom sledijo črnemu trgu. Pomembno vlogo pri odkrivanju še nepoznanih dopinških snovi imajo dopinški in forenzični laboratoriji (tudi drugi), ki z razvojem in optimizacijo analiznih tehnik omogočajo zaznavo dotlej nepoznanih dopinških snovi v vzorcih. Zelo pomemben preboj na tem področju je predstavljal razvoj sklopljene masne spektroskopije (MS), ki ne meri le tarčno, ampak meri spekter analitov. Namreč m/z razmerja in retencijskega časa (signal pri MS in kromatografiji) pri prej še nedetektiranih snoveh ne poznamo, zato tarčno merjenje ne omogoča zaznavanja teh snovi. Nekaj primerov naprednejših MS tehnik: sensitive high-resolution full-scan MS analiza, LC exact mass high-resolution MS, Q-TOF-MS, Orbitrap-MS, trojni kvadrupolni sistemi (QqQ).
Eden od načinov odkrivanja novih substanc je metabolomika. Metabolomika preučuje metabolom, ki predstavlja vse metabolite (majhne molekule), ki jih sintetizira ali presnovi organizem. Omogoča hkratno detekcijo in primerjavo več kot tisočih analitov, katerih predhodna identifikacija ni potrebna, meritve pa se izvajajo s prej omenjenimi tehnikami MS. Ker se z jemanjem dopinga spremeni metabolom, je to možen način odkrivanja uporabe dopinških sredstev in pa tudi odkrivanja novih dopinških snovi, saj se analizira veliko število majhnih molekul v vzorcu. Primerja se metabolom športnika, ki ga preiskujemo, z metabolomom športnika, ki potrjeno ni jemal dopinga (negativna kontrola) in z metabolomom “nešportnika” (slepa) ter analizira razlike v pridobljenih rezultatih. Potrebno pa je izpostaviti, da na metabolom vplivajo tudi mnogi drugi dejavniki (genetika, hrana, zdravila, ipd.) in da je hkrati pomemben tudi razvoj tehnik obdelave velikega števila podatkov in interpretacije le teh kot je na primer principal component analysis – PCA.
Pri sledenju novim dopinškim substancam igra pomembno vlogo tudi ponovna analiza starih vzorcev, ki je že pripomogla k sledenju pojavljanja novih dopinških substanc.